下面是小编为大家整理的2023年2023年抽提质粒目(四篇)【精选推荐】,供大家参考。
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抽提质粒的目的篇一
a菌种老化
建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化，涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1:500的比例进行菌种培养。二次培养时间最好不要超出16小时(或者od600不超过3.0)。
b低拷贝质粒
建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种buffer的用量。
c质粒丢失
建议：某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。
d裂解不充分
建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种buffer的用量。并确保细菌混悬均匀。
ebuffer中有沉淀未溶解
建议：bufferb1和buffern1，bufferc1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37℃温育片刻，待溶液澄清后使用。
fdnawashbuffer中未加入要求量的乙醇
建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。另外对于质粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗涤，请确保乙醇的体积不小于70%。
g离心柱中乙醇残留
建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提，大提和朝大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻(或置于65℃烘箱)，以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。
h洗脱液加入位置不正确
建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。
i洗脱液ph值不正确
建议：将dna从柱子上洗脱下来的最适ph值在7.0-8.5之间，如果洗脱液的ph超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的elutionbuffer(ph8.5，10mmtris-hcl)进行洗脱，如果用ddh2o进行洗脱，请确保ph在7.0-8.5之间。
j洗脱体积的选择
建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，请根据试剂盒要求进行二次洗脱，再用推荐的方法进行沉淀，浓缩质粒。
k洗脱时间的选择
建议：加入洗脱buffer后，室温放置2-5分钟，将有利于洗脱。
2.质粒纯度不高
a蛋白质污染
建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白。另外如果用ddh2o作为稀释溶液,测定od比值，比值可能较低，造成蛋白污染的假象，可用ph8.0的tebuffer来稀释。
brna污染
建议：检查配送的rnasea是否完全加入到buffera1中，加入rnasea后，buffera1/rnasea应该存放在4℃，如果存放时间过长，或者没有正确存放，rnasea活力下降，请重新加入rnasea。
c基因组dna污染
建议：加入bufferb1后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入bufferb1的处理时间最好不要超过5分钟。
d菌株为含内源核酸酶的宿主菌株
建议：请选用含内源核酸酶的宿主菌株质粒dna提取试剂盒，或者转化质粒到不含内源核酸酶宿主菌株中。
3.加样时dna飘出加样孔外
原因：柱中残留乙醇未除干净。
建议：洗脱质粒dna前确保无乙醇残留在柱子上。可再离心或者抽真空。
抽提质粒的目的篇二
质粒dna抽提实验报告
一．实验目的：
1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒dna的方法，提取的质粒dna可直接用于酶切，pcr扩增等。
2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测dna的纯度，构型，含量和分子量大小。
二．实验原理：碱变性抽提质粒dna是基于染色体dna与质粒dn结果a的变性与复性的差异而达到分离目的。在ph值高达12.6的碱性条件下，染色体dna的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒dna的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以ph4.8的naac高盐缓冲液去调节其ph值至中性时，变性的质粒dna又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体dna不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体dna与不稳定的大分子rna、蛋白质-sds复合物等一起沉淀下来而被除去。三．实验仪器及试剂：
1.5mlep管、高速离心机、移液枪
溶液i：
50 mmol/l 葡萄糖、10 mmol/l edta、25 mmol/l tris-hcl（ph 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶
溶液ii：
200 mmol/l naoh、1% sds 溶液iii：
3 mol/l naac（ph4.8）溶液、te缓冲液：10 mmol/l tris-hcl、ph 7.51 mmol/l edta 四．实验步骤:
1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlep管中，12000rpm/min离心1min，去上清液（重复一次）
2、加200μl溶液ⅰ重悬浮细胞
3、加200μl溶液ⅱ，轻轻摇匀，放置5min
4、加150μl溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min
5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min
6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min，12000rpm/min离心10min 7、70%乙醇洗涤沉淀2次，风干
8、加20ddh2o溶解沉淀，-20℃下保存备用
五．实验结果：得到大肠杆菌质粒dna
pcr以及电泳实验报告
一．实验原理：
pcr：该技术是在模板dna、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于dna聚合酶的酶促合成反应。dna聚合酶以单链dna为模板，借助一小段双链dna来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链dna模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，dna聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-oh末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的dna互补链。
电泳：琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于dna、rna分子的分离、分析，由于dna、rna分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。
二．实验仪器及试剂：
ep管、离心机、pcr仪、电泳槽、电泳仪、移液枪、紫外透射检测仪等 dna模板、与特定dna模板结合的引物、去离子水、商业化的dna聚合酶以及缓冲液、dntp、dna荧光染料溴化乙锭、琼脂糖凝胶
三．pcr反应体系（25μl）2× pcrmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddh2o 10.5μl
四．操作步骤 1、94℃预变性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循环7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循环23次 3、72℃，10s
4、电泳检测
五．实验结果分析
分离不同大小的dna片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表：
如右图所示：实验所用的琼脂糖凝胶浓度为1.3%，实验的dna条带位置在500bp-750bp之间，接近500bp，证明实验是成功的
2000bp 1000bp
750bp 500bp 250bp 100bp 实验组
对照组
抽提质粒的目的篇三
purifying dna with a cantifage(invirtogen)抽提质粒（小提）离心法
准备工作：
1.r3：按说明书操作加入rnsea，混匀，试剂上打√，4℃保存。2.l7：37℃预热。
3.w9、w10：按说明书操作加96-100％乙醇到w9、w10中，混匀，室温保存。4.单克隆质粒过夜摇菌。
操作步骤：
1.富集：挑取单克隆菌斑至1-5mllb液中过夜培养（2000rpm）,扩增后菌液6000rpm,离心
15min.倒掉上清。
2.重悬：离心沉淀中加入250ul r3重悬，涡旋充分混匀。
3.裂解：重悬液中加入250ul l7，上下颠倒5次混匀，室温放置5min.4.终止裂解：3中加入350ul n4 上下颠倒混匀，离心＞12000g 10min。取新柱子放入管中。
5.过柱：将4中上清液加入到2 ml柱子中，离心12000g，1min，倒掉管内液体，将柱子重新放回管中。
6.润洗：柱子中加入500ul w10，室温放置1min，离心12000g，1min，倒掉管中液体。7.润洗：柱子中加入700ul w9，离心12000g，1min，倒掉管中液体。再空离一次，彻底离去洗涤液。
8.洗脱：取一只新的1.5ml离心管，柱子放入离心管中，加入75ulte到柱子中，室温放置1min。
9.收集：12000g离心2min，得到扩增质粒，4℃保存（短期保存）/-20℃保存（长期保存）。
抽提质粒的目的篇四
中量质粒抽提 原理：
质粒中量抽提的原理及各试剂组成均有质粒小量抽提一致，其主要区别在于中量质粒抽提所获得的质粒含量更高，同时，中抽试剂盒具有去类毒素的作用，其原因可能与吸附柱中含有类似氢氧化铝等对类毒素有吸附作用的物质有关。
类毒素是指由于变性或化学修饰而失去毒性的毒素，但仍保留其抗原性。医学微生物学中将类毒素定义为：将细菌外毒素用0.3%~0.4%甲醛处理脱去其毒性，保存其免疫原性即为类毒素。仪器与试剂：
3m naac ﹑无水乙醇﹑漏斗﹑滤纸 qiagen plasmid midi kit allegra x-12r 型beckman 高速离心机﹑ph030a型培养箱/干燥箱﹑hz-2111ka型立式恒温振荡器﹑eppendorf biophotometer 步骤：
（1）将100mllb摇菌的菌液倒入50ml无菌离心管中，10℃，3700rmp离心15min，收集菌体沉淀；
若不能及时抽质粒，可将离心管倒扣在吸水纸上，待残留培养基完全吸干时，菌体沉淀-20℃保存。
（2）向菌体沉淀轻敲打散后，加入4ml p1 buffer（已加入rnase a），振荡器上剧烈振荡，重新悬浮细胞；
（3）加入4ml p2 buffer，轻柔颠倒4-6次，静置时间不可超过5min，若细菌充分裂解，可看到溶液变为蓝色；
（4）加入4ml p3 buffer，轻柔颠倒4-6次，冰上静置15min;（5）10℃，3700rmp离心10min;（6）吸附柱固定在100ml锥形瓶上，4ml qb buffer平衡吸附柱;（7）在吸附柱上放置一小漏斗，漏斗中放入滤纸，裂解上清经湿润的滤纸加入到吸附柱中；
（8）拿下漏斗，往吸附柱中加入13ml qc buffer，待过滤完后，再加入7ml qc buffer过滤；
（9）吸附柱固定于50ml无菌离心管上，5ml qf buffer洗涤并回收过滤液；
（10）往回收液中加入10ml预冷的无水乙醇和250μl 3m naac溶液，混匀，室温静置1h以上，此步完成后可于4℃保存；
（11）10℃，10000rmp离心25min，弃上清，扣干；
（12）加入2ml冰预冷的75%乙醇（先加入一定量的无水乙醇，再加入适量的水使乙醇终浓度为75%），洗涤dna；
（13）10℃，10000rmp离心25min，弃上清；
（14）室温静置5-10min；
（15）根据离心时管侧的dna量得多少，加入250-500μl无菌水于离心管中，用移液枪轻轻吹洗，回收液体于1.5ml ep管中；
（16）取4μl dna加入到196μl无菌水中，混匀，测量dna浓度。也可用1%琼脂糖凝胶电泳来检测dna浓度；
（17）标记，-20℃保存；
注意事项：
p1溶液的应储存于4度；
p2作用时间不可过长，原因同质粒小抽；
对沉淀进行洗涤时，必须先加入无水乙醇，再以水调至终浓度，否则，一旦dna溶于水中，则前功尽弃；
实验过程中多次强调低温条件，为尽可能减少dna的损耗；
细胞转染 步骤：
（1）转染前24小时将细胞培养至60-80%细胞生长密度；
（2）转染前2小时换完全培养基；
（3）配制转染试剂：
将无血清培养基、质粒、转染试剂依据不同细胞量按如下顺序加入：
无需血清培养基 质粒dna plus试剂 ltx试剂
12孔板 0.1 ml 1 μg 1 μl 2.5 μl
6孔板 0.5 ml 2 μg 2 μl
室温孵育5 min μl
室温孵育30 min 加入dna，plus，ltx后在振荡器上轻微振荡混匀；
（4）将上述配制好的试剂滴加至细胞培养上清，边加边来回晃动使转染试剂均匀分布；
（5）于37℃的co2培养箱培养24-48小时，于荧光显微镜下观察，或者免疫印迹检测目的蛋白的表达情况；
μl
10cm细胞培养皿 1.2 ml 6 μg 6 μl
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